灵芝规范化生产标准操作规程（SOP）

灵芝规范化生产标准操作规程（SOP）

前言

本规程起草单位：广州中医药大学。

本规程主要起草人：徐鸿华、张桂芳（广州中医药大学）。

第一章

总则

1.1范围。

1.1.1本标准操作规程是灵芝生产和质量管理的具体操作方法。

1.1.2本规程适用于灵芝种植者进行栽培和管理。1.2引用标准。

1.2.1《中华人民共和国环境空气质量标准》(GB3095-1996）。

1.2.2《中华人民共和国农田灌溉水质标准》(GB5084-1992）。

1.2.3《中华人民共和国土壤环境质量标准》(GB15618-1995）。

1.2.4《中华人民共和国药典（一部）》（2005年版）。1.2.5《中华人民共和国食用菌卫生标准》(GB7090-1996）。

1.2.6中华人民共和国商务部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》。

第二章

产地自然条件

2.1气温30℃、相对湿度90%、左右、空气中含0.1%二氧化碳、光照充足的条件下，灵芝可迅速正常生长发育。

2.2立地条件。土质疏松的沙质土壤。

2.3灵芝生长条件。菌丝生长前期以24~26℃生长较快，后期以24~28℃为好，菌丝体在木屑为主的栽培瓶中能耐受-10℃的短暂低温；子实体生长最适温度为25~28℃。菌丝生长阶段相对湿度维持60%为宜，子实体分化及发育期以相对湿度85%~90%为好。菌丝生长可在无光条件下进行，但全黑不能进行子实体原基的分化；子实体分化及发育要求散射光，且有趋光性。菌丝在基质中生长需要一定的氧；子实体分化与发育需要更多的氧气供应。菌丝体在PH为3.0~7.5的基质中可生长，但以PH6.0为最适宜。子实体适宜微酸环境。

2.4环境质量。

2.4.1水质达到《中华人民共和国农田灌溉水质标准》(GB5084-1992)二级以上标准。2.4.2环境空气达到《中华人民共和国环境空气质量标准》(GB3095-1996)二级以上标准。

2.4.3土壤环境质量达到《中华人民共和国土壤环境质量标准》(GB15618-1995)二级以上标准。

第三章

物种或品种类型

3.1本规程所适用的灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma.lucidum(Leyss.ex.Fr)Karst或紫芝Ganoderma.sinense.Zhao，Xu.et.Zhang的干燥子实体。

3.2菌种分离和培养。

3.2.1母种（一级菌种）分离培养。

3.2.1.1母液培养基配方马铃薯200g、葡萄糖20g、碟酸二氢钾(KH₂PO₄)3g、硫酸镁(MgSO₄·₇H₂O)维生素B₁10~20mg，琼脂15~20g。配制：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，煮沸20min，滤去马铃薯块，将滤液补足1000ml。PH自然，装入试管，在1.47×10⁵Pa灭菌30min,摆好斜面，冷却备用。

3.2.1.2母种分离。有寄主分离法、孢子弹射分离法和组织分离法。组织分离法：在无菌条件下，选取新鲜、菌蕾大、刚成熟尚未木栓化的子实体，先用清水洗净，然后用75%的酒精或冷开水冲洗药剂，用消毒的解剖刀切取菌柄和菌盖的内部，并将组织块切成黄豆大小约0.3cm的小块，接入试管培养基中央，放在28℃的阴暗条件下培养。

3.2.1.3母种生产。在无菌条件下接种，选择生长旺盛、菌龄短、菌丝层尚未出现色素分泌物的灵芝试管菌种用于转管培养。一般钩取黄豆大小菌块放入另一试管斜面培养基或三角瓶培养基中央。接种后放置24~26℃恒温箱或培养室中避光培养，接种后的前3天应每天对光检查试管中是否污染，弃去污染管，3天后隔天检查，菌丝长满斜面后即可使用。

3.2.2原种（二级菌种）生产。

3.2.2.1原种培养基配方。木屑73%、麸皮25%、蔗糖1%、石膏1%，将上述培养基粉充分拌匀后加水，使培养料的含水量达到65%，装入广口瓶或塑料薄膜袋，装瓶（袋）至瓶肩处，在料中心扎一锥形孔，封口。高压灭菌，1.5kg/cm²2h，凉后接种。

3.2.2.2原种生产。一般原种用试管菌种。在无菌条件下接种，将消毒的接种铲从试管菌种斜面培养基前端插入，将试管表面革质化菌膜与培养基剥离，推到试管底部，露出带有菌丝的培养基，挑取玉米粒大小的一块菌种，放入原种培养基中央洞边或覆盖于培养基表面，将瓶（袋）封口，置于24~28℃下培养，培养30天左右，用于接种栽培种。

3.2.3栽培种（三级菌种）生产。

3.2.3.1栽培种培养基配方。用原种培养基配方或用杂木粒78%、麸皮20%、石膏1%、黄豆粉1%，将上述培养料充分拌匀后加水，含水量掌握在60%，PH5.5~6.0，将料装入菌袋中并且捣紧，要求上松下紧，装料至袋口3~5cm时，用捣木（直径1cm）在袋中央从上至下捣一孔洞，以利灭菌和菌丝蔓延，将袋口封好，在1.5kg/cm²压力下灭菌1.5h，凉后接种。

3.2.3.2栽培种生产。一般栽培种用原种菌种。在无菌条件下，将原种培养基蚕豆粒大小的一块菌体团挑起，接入栽培种培养袋中，封口，送入培养室培养，温度保持22~25℃，阴暗条件，同时要求室内清洁，空气新鲜，注意观察有无杂菌生长，发现杂菌立即处理，培养30~35天，菌丝长满后接种到段木上。

第四章

栽培技术

4.1选地。选择水源方便，排水良好，地势开阔，通风透光，土质疏松的沙质壤土建场。

4.2整地深翻土壤30cm，除净杂草石块，暴晒做畦，畦东西走向，畦宽1.3m，长视地形而定，高畦间留步道。整地时，进行土壤消毒。

4.3搭棚。畦上方搭设阴棚，加盖遮阴网，以三分阳七分阴为好，场地周围亦用遮阴网，光线亮度要求均匀。

4.4段木选择、砍伐、切段、装袋、灭菌。应选用山毛榉等阔叶树作段木，树种选好后，在树液流动前，一般在树木贮存营养较丰富的冬季砍伐，直径5~20cm。锯成长为18cm一段，段木含水量为407。左右，直径较小的段木可捆扎成捆，每捆直径35cm左右，捆时断面要平，并用小段木或劈开的段木打紧。用塑料袋包装，把袋口扎紧，进行灭菌。

4.5接种培养选择室温20℃左右，晴朗天气，在无菌条件下接种。取栽培种一小块接入菌材，放在洁净房内进行暗培养，段木菌袋依“品”字形摆放，前期室温24~26℃，后期室温为22~24℃，室温低于20℃时应加温。室内相对湿度为60%~70%，保持空气流动。培养2~2.5个月，长满菌丝体后移出室外埋土。

4.6菌材埋土。当菌材出现少数原基、气温回升到20℃以上时，选择晴天，在整好的畦上先开沟，将菌材直立排于沟内，接种面朝上，菌材间距一般为4~6cm，菌材上面平齐，用细土填满菌材间隙，上端覆盖消毒细土或黄心土1~2cm。

第五章

出芝管理

5.1调控适度。灵芝喜潮湿环境。在菌蕾露土、菌盖出现前，保持棚内相对湿度80%~90%，子实体生长最适的空气相对湿度为85%~90%。土壤湿度为50%为宜。阴雨天湿度偏高，采用通风降湿，畦内停止淋水；晴天湿度偏低，畦内喷水并向空间喷雾，提高棚内空气相对湿度，水质要干净。

5.2改善通气条件。灵芝为好气性真菌，子实体对CO₂极为敏感，只有CO₂浓度低于0.1%时，才能生长出菌盖大、厚、完整和菌柄短的优质子实体。

5.3调控光线。灵芝子实体对光线要求较高，需要较多的散射光，避免直射光，且有强烈的趋光性。因此要使棚内的光亮度调整到400~500cd范围,光源固定。

5.4调控温度。灵芝生长过程均在气温较高的季节完成。子实体分化和生长最适温度为25~28℃，昼夜温差8~10℃。低于25℃时要关好棚门，盖好塑料薄膜保温，超过30℃时要打开棚门，揭开周围塑料薄膜，加强通风降温，棚顶喷水降温。

第六章

主要病虫害的防治

坚持贯彻保护环境、维持生态平衡的环保方针及预防为主、综合防治的原则，采取农业防治和化学防治相结合的方法，做好病虫害的预测预报和药效试验，提高防治效果，禁止使用国家禁用农药，将病虫害对灵芝的危害降低到最低限度。

6.1农业综合防治。

6.1.1环境管理。对半地窖大棚搭架袋栽出芝的，不同品种分棚管理，协调好温度、湿度、通气和光照，避免温差、湿差及水分过大，定期定时通气和透光，增强芝蕾生活力，使其正常分化、生长。

6.1.2卫生管理。芝房内外环境需要经常进行消毒、防虫处理，窖棚门窗、通气孔用纱网封严，防外来虫源侵入。喷水要用清洁水源，及时清除废料、杂物及脏水，定期用石炭酸、高锰酸钾、石灰粉、敌敌畏和辛硫磷等药剂杀菌灭虫，特别要注意防止土畔或菌墙中土居害虫的危害。

6.1.3受害灵芝处理。发现有病害、杂菌子实体，应及时用漂白粉、甲醛或30%NaOH溶液进行喷洒或擦洗；对于子实体上的害虫，一方面进行人工捕捉，另一方面剪除有虫幼芝，避免转移危害，必要时可用敌杀死、橘皮煮液等避芝喷杀或用灯光糖醋液诱杀。

6.2青霉菌、毛霉和根霉菌。

6.2.1农业防治。加强通风换气，在不影响灵芝生长条件下降低相对湿度；一旦发生霉菌污染的病芝要及时摘除；采摘后芝场要清理干净。

6.2.2化学防治。用5%新洁尔灭1000倍液喷雾灭菌。

6.3褐腐病。

6.3.1农业防治。注意通风和保湿；避免高温高湿；及时清除病害的芝体。

6.3.2化学防治。用5%新洁尔灭1000倍液喷雾灭菌。

6.4蛞蝓。

6.4.1农业防治。搞好芝场卫生；在夜间进行捕杀；做成毒饵进行诱杀。

6.5跳虫。

6.5.1农业防治。改善芝场环境卫生，防止芝场积水。

6.5.2化学防治。用0.4%敌百虫喷洒。

第七章

采收与加工

7.1采收。

7.1.1孢子粉采收。当灵芝进入成熟期，即子实体的边缘消失，孢子开始释放后，适时套袋，过早过晚均不利。由于孢子粉很轻，随空气流动向周围扩散，一般采用套纸袋收集，用纸袋将产生孢子的菌盖罩住，成熟一个套一个，套袋时要防止孢子粉向外飞散，采收时取下纸袋，轻轻刷下纸袋内的孢子粉。

7.1.2子实体釆收。当菌盖充分展开，边缘白色生长圈消失，不再增大，增厚也不明显，菌盖颜色色泽均匀，褐色孢子粉释放一段时间即可采收。采收时将芝体从柄基部摘下，不要用剪，留下老柄，以免老柄上方剪口长出朵形很小或畸形芝体。

7.2干燥釆收回的孢子粉或子实体放在太阳光下晒干，或置于烤房内及时烘干，直接烘干时，烤房温度由40℃逐渐上升到65℃，先晒1~2天再烘，烤房温度控制在55~65℃，烘至灵芝菌盖碰撞有响声，再烘干也不再减重时为止，即含水量在11~12%时为宜。

7.3段木栽培灵芝子实体分级标准目前采用菌盖大小、厚度、色泽分级。

一级菌盖最窄面7cm以上，中心厚度1.2cm以上，含水量12%以下，菌盖整齐，盖表面粘有孢子，腹面管孔浅褐色或浅黄白色，无斑点，菌柄长小于2cm，无霉斑，无虫蛀。

二级菌盖最窄面以上，中心厚度1cm以上，菌盖基本完整，无明显畸形，盖表面粘有孢子，菌柄长2cm以内，无霉斑，无虫蛀。

7.3.3三级菌盖最窄面3cm以上，中心厚度0.6cm以上，菌盖展开，菌柄长不超过3cm，无霉斑，无虫蛀。7.3.4等外级菌盖大小、厚度、菌柄的长短不作要求，无霉斑，无虫蛀。

第八章

留种技术

8.1声芝菌种保藏。

8.1.1菌种瓶。在菌种瓶菌丝长入培养料1/2或2/3时，取出菌种瓶，用灭菌过的薄膜与牛皮纸代替棉塞封口，绳扎紧后再用矿物蜡密封。将菌种瓶用黑布或黑纸包好后置4℃冰箱中保存，一般可保存1年。

8.1.2试管斜面。试管斜面菌种存放在4℃冰箱中保存，但保存期短，宜存放3~6个月后移管1次，移管次数不宜多，次数多容易造成菌种老化。将去除水分的液体石蜡油注入试管斜面中，使油高出试管斜面尖端1cm即可，注意添加石蜡及1~2年移管1次，可保存2~10年。8.2灵芝菌种提纯复壮。通过对保藏菌种进行移管培养，使其菌株恢复到原菌株的生长状况。或对该菌株进行人工栽培，对子实体进行组织分离，让新得到的菌丝体恢复到原菌株的生长势。

第九章

质量标准及监测

9.1质量标准。

9.1.1外观性状。

①子实体：赤芝菌盖木栓质，肾脏形或半圆形，近圆形罕见，直径12cm×20cm，厚1~2cm，初黄色，后渐变为红褐色和红紫色或暗紫色，具有漆样光泽，有环状棱纹和辐射状皱纹；边缘薄或平截，常稍内卷；菌肉白色，后变为浅褐色；管口初期白色，后期呈褐色。菌柄侧生，呈类圆柱形，扁圆柱形，长达直径0.5×1.5cm，紫褐色，光泽较菌盖显著。孢子褐色，卵形，8.5~11.5μm×5~6.5μm，中央含一个大油滴。

②孢子粉：干燥粉末，无结块，无杂质，褐色或灰褐色；孢子呈淡褐色至黄褐色，卵形，顶端常平截，双层壁，孢内壁淡褐色至黄褐色，有突起的小刺，外胞壁平滑，无色。

9.1.2显微。菌盖皮鞘由棕黄色栅状组织形成。菌肉中菌丝近无色或带褐色，有分枝，多弯曲，直径1.5×6μm，壁厚。子实层着生菌管内侧，成熟子实体因子实层变瘪而看不清担子。孢子卵形或顶端平截8.5~11.2（12.1）μm×5.2~6.9μm，外壁无色，平滑，内壁有小刺，淡褐色或近褐色。

9.1.3内在质量。

①子实体：按《中华人民共和国药典（一部）》（2005年版）要求，杂质不得≥2.0%；水分≤13.0%；总灰分≤3.2%；酸不溶性灰分≤0.5%。

②孢子粉:细菌总数＜1000个/g；霉菌总数＜50个/g，大肠菌群＜30个/g，致病菌不得检出。砷＜0.5mg/kg，铅＜1mg/kg，汞＜0.1mg/kg。

9.2质量监测。

9.2.1含量监测。

9.2.1.1浸出物按《中华人民共和国药典（一部）》（2005年版）水溶性浸出物测定法项下的热浸法（附录X.A）测定，不得＜3.0%。

9.2.1.2农药残留监测。据中国广州分析测试中心对龙门灵芝基地的灵芝子实体按《中华人民共和国药典（一部）》年版）（附录IX.Q有机氯类农药残留量测定法）测定：六六六（BHC)未检出、滴滴涕(DDT）未检出、五氯硝基苯（PCNB）未检出、艾氏剂(Aldrin)未检出，远远未超过国家有关规定。

9.2.1.3重金属含量监测。据中国广州分析测试中心对龙门灵芝6紗基地的灵芝子实体按《中华人民共和国药典（一部）》（2005年版）对铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录XI.B原子吸收分光光度法或附录XI.D电感耦合等离子体质谱法）测定:重金属总量＜20mg/kg；铅＜0.5mg/kg；镉＜0.28mg/kg；铜＜6.3mg/kg；砷＜0.5mg/kg；

汞＜0.1mg/kg。符合GB7090-1996食用菌卫生标准规定，均在中华人民共和国商务部发布《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定的允许范围内。

9.2.1.4灵芝酸B含量测定。索氏法提取较佳（4h），同时对提取后的残渣再以氯仿提取检测，灵芝酸B可基本提尽。

9.2.1.5测定结果。龙门基地的赤芝含灵芝酸B0.26%。

9.2.1.6灵芝多糖含量测定。

对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，加水制成1ml含0.1mg的溶液，即得。

精密称取供试品2ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量（mg），计算，即得。

《中华人民共和国药典（一部）》规定，本品按干燥品计算，含灵芝多糖以无水葡萄糖（C₆H₁₂O₆）计，不得＜0.50%。

广州中医药大学龙门研究基地对赤芝多糖含量测定，釆用加蒸馏水在沸水浴上提取多糖的方法，栽培品宜1.5~2.0h，野生品宜4h。用氢氧化钠或草酸作为提取剂，可获得较多的灵芝多糖。以85%的酒精提取测定多糖比较合适。多糖含量测定用苯酚-硫酸法，测定结果为0.97%。

9.2.2灵芝多肽的分离检测。

9.2.2.1供试品溶液的制备。取灵芝子实体热水提取液浓缩，用乙醇沉淀，上清液流经732（H）型阳离子交换树脂柱，以蒸馏水洗脱除尽糖后，改以3%NH₃·H₂O洗脱，收集洗脱液中茚三酮显色部分，冻干得粗肽。以少量水溶解，加样于PH5.0（用稀HAC平衡）DA-201大孔吸附树脂柱,0.01mol/LHOAC洗脱，可见色素被吸附，多肽则从洗脱液中洗出，测定紫外吸收，最大吸收峰在210nm和254nm处，洗脱液浓缩后，流经凝胶Sephade×G-15柱，以H20洗脱，紫外254nm检测，使多肽与氨基酸和盐分开，收集多肽组分，冻干后，以0.01mol/L，NH₄HCO₃缓冲液溶解，加样于DEAE-Cellulose柱进行分离，分别以0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L，PG8.5NH₄HCO₃缓冲液进行阶段性梯度洗脱，紫外检测，共收得GPC₁~GPC₅五个组分。

9.2.2.2检测方法以新华VI号层析滤纸，电泳液为PH7.2的Tris-HCL缓冲液，工作电压1200V,电泳时间6H对上述多肽进行高压纸电泳，以CL₂-KI-淀粉和茚三酮分别对照显色。

9.2.2.3检测结果GPC₁和GPC₂为碱性肽，GPC₃为中性肽GPC₄和GPC₅为酸性肽。

第十章

包装、贮藏及运输

10.1包装干燥后的灵芝釆用无污染、清洁、干燥、无破损的塑料袋盛装，最好真空密封，再用纸箱进行外包装，或装入双层袋（一层塑料袋，一层编织袋）或其他防潮容器，同时做好包装记录，其内容应包括品名、规格、产地、批号、重量、包装工号、包装日期等。

10.2贮藏。经包装的灵芝贮藏在通风、低温、干燥（含水量控制在10%)、避光、地面整洁、无缝隙、易清洁的仓库，贮藏时间过长，常被一种鞘翅目昆虫蛀食，严重时可将灵芝蛀成粉末状。一般情况下，贮藏不要超过1年。

10.3运输。灵芝在批量运输时，不应与其他有毒、有害、易串味物质混装。运载容器应具有良好的通气性，以保持干燥，并应有防潮措施。